image: 四个生物催化元件依次执行功能，实现化学合成多肽与重组表达蛋白的无痕拼接，展示出广阔的应用范围。 view more
Credit: ©《中国科学》杂志社
蛋白质是所有生命的物质基础，也是生物体行使功能最重要的载体。蛋白质的获取与改造长久以来一直是生命科学研究的核心问题之一。虽然经典重组表达技术能够提供天然蛋白质，但其所能利用的分子砌块受到20种天然氨基酸的限制。伴随着蛋白质组学研究和生物医药产业的迅速发展，人们对于具有化学修饰与新型胺基单元的非天然蛋白质的需求与日俱增。因此，突破生物学中心法则的限制，创造出任意结构的蛋白质，不仅可以拓展人们对蛋白质这一生命核心元件的理解，也是人工设计生命的重要基础，具有深刻的科学意义。
从化学本质分析，蛋白质是胺基单元通过碳氮成键反应形成的生物大分子。因此，蛋白质的人工合成关键在于碳氮成键反应的精准控制。近年来，以多肽固相合成与特异性拼接为核心的蛋白质合成和修饰技术蓬勃发展，打破了核糖体合成系统仅能使用天然及少数非天然氨基酸的瓶颈，使原子水平的蛋白质人工构筑成为可能。然而，由于多肽侧链上的官能团会与拼接位点处的酰基与胺基形成竞争，目前主流的多肽拼接方法均需设计特殊的连接位点，在合成完整的蛋白质时，留下相应的“疤痕”。
中科院微生物研究所的吴边团队长期从事基于计算的微生物碳氮成键酶的机制解析与设计重构工作。近日，该团队与跨国药企费森尤斯集团合作在National Science Review报道了他们关于无痕蛋白质酶法合成平台PALME的研究成果。该平台基于合成生物学理念，对微生物酶资源进行深度挖掘与大尺度计算重塑设计，围绕复杂体系下的碳氮成键反应，串联多个催化元件，以逐级定向活化的方式，使无侧链保护的多肽能够在水相中完成无痕拼接，进而实现完整蛋白质的酶法合成。
PALME平台由上游的活化模块和下游的连接模块组成。该平台的输入端可兼容固相合成多肽或重组表达的天然蛋白质。对底物序列无特定限制，仅需在C端引入一个额外甘氨酸。由多肽氧化酶、裂解酶和修饰酶共同组成的活化模块可以将C-端的甘氨酸定向无痕活化。经由上游模块处理的活化多肽，随即可被下游的连接模块所识别，在广谱的人工多肽连接酶（Peptiligase系列酶）的催化作用下，与另一多肽完成拼接。得益于催化元件的高度位置选择性，该平台的输出端可生成N/C端修饰蛋白质、中段修饰蛋白质、以及环状蛋白质，为任意结构的人工蛋白质合成提供全局解决方案。
借助PALME平台，该团队对一系列重要的药物多肽与非天然蛋白质的合成进行了展示。在新型糖尿病药物艾塞那肽的全合成案例中，首次实现了固相合成多肽的N-to-C酶法级联组装。在环化合成实验中，实现了无天然环化酶识别位点的SMAP抗菌肽环化。在功能蛋白的半合成实验中，该团队成功将化学合成片段与重组蛋白质拼装，所获得的半合成异构酶表现出与完整重组酶等效的催化活性。此外，他们还展示了极具挑战的蛋白质双向连接，将化学合成的多肽的两端分别与其他重组蛋白质进行拼装，实现了无自然化学连接位点的乙酰化修饰蛋白质的合成，成功的扩展了蛋白质人工合成的应用空间。
近年来，人工智能技术对蛋白质结构预测与功能设计领域产生了颠覆性的影响。合成生物学家开始突破天然氨基酸的维度限制，将高阶的化学变化引入到蛋白质的设计空间。该平台技术的发展，为非天然功能蛋白质的构筑提供了物质工具基础，有望对合成生物大分子元件设计的扩展提供有力的支撑。
中国科学院微生物研究所的李瑞峰高级工程师、朱彤博士研究生与费森尤斯的Schmidt博士为该研究的共同第一作者，费森尤斯的Nuijens博士与吴边研究员为论文共同通讯作者。该工作的完成还得到微生物研究所方敏研究员与严景华研究员的大力协助。该项研究得到了国家重点研发计划合成生物学专项、国家基金委优青项目、中国科学院先导专项、战略生物资源服务网络计划生物资源衍生库、前沿科学研究计划“从0到1”原始创新项目的支持。
研究详情请见原文：
Traceless enzymatic protein synthesis without ligation sites constraint
https://doi.org/10.1093/nsr/nwab158
Journal
National Science Review