单细胞测序新突破：华中科技大学李一伟团队等开发基于全谱N-糖标记的多重单细胞/单核RNA测序技术Toti-N-Seq

研究背景

单细胞RNA测序技术的快速发展已使其能够同时处理数万乃至数十万个细胞，但面对人体约36万亿个细胞的庞大规模以及制药工业、临床研究等领域日益增长的需求，迫切需要进一步的规模化突破。多重单细胞测序技术通过预先标记不同样本，允许混合处理和测序，不仅能显著提高实验通量、降低成本，更能有效消除批次效应和识别技术假象。然而，现有的多重化技术存在明显局限性：基于抗体的方法难以找到在所有细胞类型中普遍表达的靶蛋白，特别是在核酸样本中更加困难；脂质锚定方法虽适用范围广但结合力弱且动态变化，容易导致交叉污染；基因标记方法则面临效率差异大、预处理时间长等问题。更关键的是，现有技术往往只能适用于单细胞测序或单核测序中的一种，缺乏真正的通用性。因此，开发一种高效、低污染、广泛适用且同时兼容单细胞和单核测序的通用型多重化技术，成为了当前领域的重要挑战和迫切需求。

研究进展

技术亮点：瞄准细胞表面的"糖衣"

与现有的通用技术不同，Toti-N-Seq技术巧妙地将目标锁定在细胞表面广泛存在的N-糖链上。这些糖链就像是细胞表面的"通用标签"，在几乎所有真核细胞中都普遍存在，为实现真正的通用型样本标记提供了理想的靶点。研究团队通过工程化改造，开发出了链霉亲和素-Fbs1 GYR变体融合蛋白（Stv-Fg），该蛋白能够特异性识别所有类型的N-糖链，实现对细胞和细胞核的高效标记。  

性能表现：精准度创新高

实验数据显示，Toti-N-Seq技术表现出色。在分类准确率方面，单细胞测序达到96.9%，单核测序更是高达98.7%，远超现有的基于蛋白质或脂质标记的多重化技术。同时，该技术在样本比例保真度方面也表现优异，输入样本比例偏差始终控制在4%以内，确保了测序深度在各样本间的均衡分布。更值得关注的是，该技术的双细胞检出率极低，单细胞测序仅为0.04%，单核测序仅为0.02%，有效提升了数据质量。此外，Toti-N-Seq还能够可靠检测占比低至0.5%的稀有细胞亚群。

技术优势：一个方案解决多重难题

Toti-N-Seq技术最大的优势在于其出色的通用性。该技术适用于多个物种和几乎所有真核细胞类型，更重要的是，它既可用于单细胞测序，也可用于单核测序，这是目前其他技术难以实现的。在操作便利性方面，该技术仅需不到3分钟的样本准备时间，采用一步法操作，非常适合规模化应用。

在技术可靠性方面，Toti-N-Seq展现出了显著优势。标记后的样本即使混合长达90分钟也不会出现明显的交叉污染，有效避免了传统脂质标记方法因动态结合导致的样本间串扰问题。这种高保真度的标记特性确保了多重化样本的准确性和可重复性。

临床样本应用：从基础研究到临床转化

为了验证技术的实用性，研究团队成功将Toti-N-Seq技术应用于人类外周血单核细胞（PBMC）的多重化测序分析。结果显示，该技术不仅能够准确识别各种主要免疫细胞类型，包括CD14+单核细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、B细胞、NK细胞等，还成功检测到了占比仅0.5%-1.3%的稀有浆细胞样树突状细胞（pDCs）。这一结果充分证明了该技术在临床样本分析中的巨大潜力，为免疫学研究和临床诊断提供了重要的技术支撑。

研究团队还进一步验证了该技术的扩展性，成功实现了6重和12重样本的多重化测序，并在小鼠PBMC以及人鼠混合样本中都取得了优异的表现。这些结果表明，Toti-N-Seq技术具备了从实验室研究向临床应用转化的技术基础。

未来展望

Toti-N-Seq技术的问世标志着单细胞测序样本多重化技术迈入了新的发展阶段。该技术不仅能够显著降低测序成本、消除批次效应，还为大规模队列研究、临床诊断和药物开发提供了强有力的技术支撑。特别值得一提的是，该技术易于与其他生物分子标记和基因扰动技术集成，为进一步拓展与表观遗传标记、蛋白质组学等多组学数据的整合能力，实现单细胞水平的多维数据联合分析，为解析细胞功能调控网络提供新工具。

随着精准医学和个性化治疗需求的不断增长，Toti-N-Seq技术的出现恰逢其时。该技术不仅解决了现有多重化方法的技术瓶颈，还为单细胞测序的规模化应用提供了可行的解决方案。团队将优化现有6-plex与12-plex标记体系，开发更高通量的24-plex以上标记方案，以满足超大规模样本队列研究的需求，例如跨器官细胞图谱构建或药物筛选中的多条件并行检测。相信在不久的将来，这一技术将在基础研究、临床诊断和工业应用等多个领域发挥重要作用。

来源：https://spj.science.org/doi/10.34133/research.0678